«Водяная игрушка» — дословный перевод с ацтекского языка слова аксолотль. Кандидат биологических наук, доцент СПбГУ Егор МАЛАШИЧЕВ в сотрудничестве с немецкими коллегами развивает на кафедре эмбриологии СПбГУ методики работы с этими личинками амбистом, ранее не применявшиеся в Университете.

Типичная схема эксперимента по трансплантации тканей от трансгенных эм- брионов к эмбрионам дикого типа. Здесь пересадке подвергались грудные мы- шечные зачатки (сомиты), второй — от эмбриона с зелёным флуоресцентным белком во всех клетках, третий — от эмбриона с красным флуоресцентным белком во всех клетках; у личинки (внизу) при освещении светом разной длины волны можно увидеть оба пересаженных сомита. В результате подобных опера- ций удалось установить, что верхняя часть лопатки у аксолотля развивается из трёх сомитов (справа внизу).

В преддверии Дня Победы принято говорить о патриотизме, ведь подвиг советского народа в борьбе с фашизмом невозможно переоценить. Однако приятно и сознавать, что недаром прошли десятилетия с этих событий. Отношения России и Германии кардинально изменились. Совместная работа ученых наших стран приносит заметные плоды. Об одном из таких примеров мы и рассказываем сегодня.

Окончив аспирантуру СПбГУ, биолог Егор Малашичев уехал постдоком в Германию, в город Фрайбург, и там впервые стал заниматься экспериментами в области биологии развития. Изначально курино-перепелиными химерами (это когда куриным эмбрионам пересаживают часть тканей перепелиных эмбрионов и следят за судьбой клеток, чтобы понять, как идет дальнейшее развитие и из чего формируются те или иные ткани), а затем и аксолотлями.

От химер к флуоресцентным белкам

Вопрос «откуда что берется?» — каким образом развиваются органы и ткани организма — один из основных для эмбриолога. Со временем методика проведения экспериментов, изучающих эмбриональное происхождение тканей и органов эмбриона, серьезно изменилась. Но идея изначально одна: каким-либо образом пометить определенную часть клеток эмбриона, например, нервный гребень, чтобы проследить, во что они разовьются.

Задача — каким образом пометить клетки, чтобы их легко было различить и в дальнейшем, на следующих этапах развития эмбриона? При химеризации, то есть пересадке тканей от эмбриона одного вида животного к эмбриону другого вида (между разными видами тритонов, например), смотрели на морфологические различия: у пересаженных клеток крупнее ядра, больше цитоплазмы, и так далее. Но это метод не самый надежный, избежать ошибок удается не всегда.

Шагом вперед стало открытие, сделанное в начале 60-х Николь Лё Дуарен. Она обнаружила, что с помощью специальной окраски (по Фёльгену) ядра куриных и перепелиных клеток окрашиваются по-разному. Этот метод отличался гораздо более высокой надежностью и дал толчок к исследованию эмбрионального происхождения различных органов у эмбрионов птиц.

Клетки в живых эмбрионах помечали также и с помощью специальных красителей и прослеживали их «путешествия»

Недавно прооперированный эмбрион (1), трёхдневный эмбрион (2) и подрос- шая личинка (3, вид с брюшной стороны) экспериментальных аксолотлей, у ко- торых были пересажены нервные валики от зелёных трансгенных эмбрионов и помечены все производные нервного гребня (совокупности клеток, выселя- ющихся из нервных валиков при замыкании их в нервную трубку). У личинки видны помеченные стволы нервов, пигментные клетки, соединительная ткань и хрящи жаберной области и другие структуры, развивающиеся из этой эмбриональной ткани

в процессе формирования органов эмбриона. Однако этот метод оказался менее совершенным. При делении клеток краситель, естественно, разбавляется, и чем дольше в развитии мы хотим отслеживать клетки, тем это труднее. «Применяли и более современные методики, — рассказывает Егор Борисович Малашичев. — Стали использовать искуственные плазмиды — носители определенных генов. Удобны в использовании оказались вирусы, особенно ретровирусы, на основе которых искуственно, методами генной инженерии, создаются так называемые вирусные конструкции: в них встраивают гены флуоресцентных белков. Белки и оказываются маркерами в клетках. Чтобы при делении клеток не происходило такого же разбавления, как и при методе красителей, используются вирусы наподобие ВИЧ, которые встраиваются в геном и реплицируются в клетках-«потомках». Вот такой способ оказался весьма надежным».

С развитием технологий стали создавать трансгенных животных разного типа, в том числе с такими встроенными новыми генами, например, флуоресцентных белков.

«Очень удачной оказалась идея использования нужного гена, экспрессия которого регулируется в искуственной конструкции промотором (участком ДНК, который является сигнальным для начала специфической транскрипции гена) от другого гена, — говорит Егор Малашичев. — Если мы выберем такой ген, который экспрессируется во всех клетках организма, например актин, — то вместе с ним будет экспрессироваться и нужный нам ген, например, флуоресцентного белка, и тоже повсеместно. Таким образом задача «пометки» нужных клеток и их дальнейшего отслеживания оказалась решена. Благодаря развитию направления по созданию новых типов флуоресцентных белков сейчас можно красить клетки в живом организме буквально в радугу. Тех же аксолотлей вывели сначала зеленых (в 2006 году), потом красных (в 2009), причем красные бывают двух типов. Одни цитоплазмотические, а другие ядерные. Ядерные отличаются тем, что у них только ядра клеток окрашены (там накапливается красный флуоресцентный белок Черри). Такие аксолотли похожи на звездное небо: если осветить их светом определённой длины волны, они все становятся в мелкую красную крапинку. Потрясающее зрелище».

Чем прекрасен аксолотль?

Если мы не берем в расчет внешность аксолотля, весьма симпатичного существа, похожего на головастого тритона с ореолом наружных жабр с обеих сторон головы, то прекрасен он тем, что оказался чрезвычайно удобным объектом для ученых-эмбриологов. «Во-первых, потому, что его эмбрионы достаточно крупны и легко доступны: как и  многие другие амфибии, аксолотль откладывает икру на в воду, — объясняет Егор Борисович Малашичев. — Во-вторых, аксолотли отличаются чрезвычайной способностью к заживлению ран и регенерации, у них очень хорошо восстанавливаются ткани после повреждения, что удобно для операций: зашивать не надо, через два часа вы уже не найдете места, где проводили разрез». К тому же, икры аксолотли откладывают много, поэтому недостатка в материале испытывать не приходится.

Аксолотли впервые стали применяться в исследованиях по биологии развития в США. В Европе аксолотлями стал заниматься Свен Хёрстадиус, проведший с ними много опытов еще до изобретения трансгенных организмов. В 70–80-е годы интерес к аксолотлям постепенно ослаб: казалось, что возможности использования этой модели исчерпаны. Однако с появлением новых методик, о которых шла речь выше, эмбриологи вновь обратились к аксолотлям. Велик был соблазн проверить, насколько точны были предшествующие изыскания, выполненные на межвидовых химерах.

Колония трансгенных аксолотлей и лягушек в подвале вивария. Слева — розовые молодые аксолотли, несущие в своих клетках флуоресцентный белок Черри, справа — аквариумы со взрослыми аксолотлями и шпорцевыми лягушками

На новом этапе

Первые работы с трансгенными аксолотлями стала проводить группа Элли Танака в Техническом университете в Дрездене. Например, они проверили существовавшую гипотезу о том, что при регенерации утраченной конечности клетки на обрубке, из которого вырастает новая лапка, полипотенциальные, то есть используются для формирования всех тканей в регенерирующей лапке. Что сделали биологи группы Танака: они пересадили кожу трансгенного зеленого аксолотля обычному и лишили его одной лапки. Однако у новой отросшей лапки зеленой была только кожа. В ходе второго эксперимента, при пересадке трансгенной зеленой мезодермы на бок животного, в отросшей конечности они получили зелеными исключительно хрящи или мышцы. В третьем случае пересадка касалась клеток нервного гребня, дающего оболочки нервов, и опять другие ткани не образовывались де ново. Следовательно, заключили ученые, клетки, идущие в ход для регенерации, сохраняют память о своей прошлой судьбе, благодаря которой развиваются в те же ткани, что и раньше, то есть являются мультипотентными.

С группой Танака в  Дрездене познакомился Егор Малашичев, и они стали работать вместе.

Во все лопатки аксолотлей

Интерес Егора Малашичева привлек пояс передних конечностей аксолотля, в частности, его лопатки. Дело в том, что в работе Руиджина Хуанга, китайского исследователя, работающего в Германии, опубликованной в 2000 году, содержалась информация о том, что лопатка у птиц развивается не из скелетогенных, а из мышечных зачатков (миотомов сомитов). Другие исследователи, разумеется, проверяли эту идею и на аксолотлях: удаляли у эмбриона аксолотля сомиты. Лопатка развилась нормальная. «Казалось бы, идея опровергнута — однако эксперимент с удалением нельзя назвать лучшим методом: вспомним о способностях аксолотлей к регенерации. Поэтому с появлением трансгенных аксолотлей мы решили проверить эту идею другим, более современным методом», — говорит Егор Малашичев.

Студентки бакалавриата кафедры эмбриологии Ася Давидьян и Катя Купряшова на летней практике по экспериментальной эмбриологии позвоночных животных. Под бинокуляром —- куриное яйцо, один из основных объектов эмбриологов

Ученые «покрасили» сомиты аксолотля в разные цвета — красный и зелёный. Когда у выросшей личинки развилась лопатка, стало очевидно, что как минимум три сомита (третий, четвертый и пятый) внесли свой вклад в ее формирование. «Следовательно, лопатка действительно имеет двойное происхождение — как из скелетогенных, так из мышечных зачатков», — заключает Егор Борисович.

Поводом для развития исследования послужила статья, опубликованная  коллективом под руководством Джорджио Кёнтгенса в журнале “Nature” в 2005 году. Там говорилось, что из нервного гребня, помимо прочего, развивается соединительная ткань в тех местах, где мышцы прикрепляются к костям, причем только в том случае, если сами кости сформировались из клеток нервного гребня. Вывод был следующий: по мышцам можно судить о происхождении костей. Эксперимент проводился на мышах, у которых, как показывалось, из нервного гребня формируется передний край лопатки и мышцы, ведущие от него к черепу, как бы создавая мост между туловищем и головой. Выводы о нервном гребне проецировались и на другие виды позвоночных.

«Это был бы логичный вывод, если бы исследовалось 2-3 вида, принадлежащих к разным классам позвоночных животных, — считает Егор Малашичев. — Поэтому мы решили провести проверку на аксолотлях и посмотреть: есть ли у них клетки нервного гребня в составе лопаток?» Вновь ученые прибегли к трансгенным аксолотлям, пересаживая практически полностью их нервный гребень их обычным белым собратьям. Но сколько ни растили личинки, как пристально их ни изучали — ни малейших следов нервного гребня в лопатках аксолотлей не нашли. Статью с результатами всех экспериментов и выводами об эволюции плечевого пояса попытались отправить в “Nature”, где была изначальная статья, выводы которой со всей очевидностью опровергались нынешним экспериментом. Однако не повезло: в роли рецензента оказался один из авторов той самой статьи. Зависли на стадии длинных споров в переписке с ним, и в итоге опубликовали только часть результатов в другом журнале.

«Сам по себе это был очень интересный и поучительный опыт общения с редакцией и рецензентами одного из топовых журналов, а исследования привели попутно к открытию других любопытных фактов, на которые ранее не были даже нацелены наши исследования — рассказывает Егор Борисович. — Например, обнаружили, что почка развивается не из одного зачатка — нефротома, как предполагалось ранее, а из двух: также участвует боковая мезодерма, формируя в почке соединительную ткань».

Дальнейшая судьба аксолотлей в СПбГУ

В результате сотрудничества с немецкими учеными, которые делились своими методиками и помогали в организации совместных исследований, и при содействии немецкого фонда Александра фон Гумбольдта, обеспечившего лабораторным оборудованием (приобрели флуоресцентный бинокуляр), в СПбГУ удалось на современном уровне организовать работы в области экспериментальной эмбриологии позвоночных животных. Этой темой занимаются студенты (у Егора Малашичева уже защитились 2 магистра и 2 бакалавра, скоро еще двое ребят будут защищаться по темам с использованием  эмбрионов кур и аксолотлей).  Уже самостоятельно, в лаборатории СПбГУ, было проведено последнее на данный момент исследование подъязычного аппарата аксолотлей. Эти результаты еще не опубликованы, общий вывод — вся сетка хрящей, поддерживающих жаберные дуги, также имеет двойное происхождение (развивается из мезодермы и нервного гребня).

«Эти результаты студентка 4 курса Ася Давидьян докладывала только что на конференции «Ломоносов-2013», получила грамоту за лучший доклад. Ближайшие планы — будем представлять суммарные результаты по аксолотлям на Международном конгрессе по биологии развития, который состоится в июне в Мексике», — отчитывается Егор Малашичев.

Ложка дегтя в этой бочке научного меда — бытовые сложности, связанные с организацией экспериментов. «В старых зданиях трудно организовать современные чистые лаборатории, — объясняет ученый. — Наша лаборатория находится на первом этаже здания на Менделеевской линии, 5, и как бы мы ни старались, по стенам из подвала все равно идет влага, как следствие, развивается грибок. То же и в старом здании вивария, где колония трансгенных аксолотлей расположена в подвале. В результате икра, отложенная аксолотлями, и даже хуже — оперированный эмбриональный материал — быстро погибают. Перепробовали всевозможные антибиотики, антимикотики — ничего не помогает». Ученые все-таки нашли свой метод: промывать икру аксолотлей спиртом в дуршлаге, а потом водой. Благодаря такой «научной находке», вернее, находчивости, и удалось довести работу до конца…

Елизавета Благодатова